歡迎來到 旋樂吧最新在線網址

免費注冊

首頁 | 產品 | 求購 | 資訊 | 專題 | 找廠商 | 打聽 | 人才 | 品牌 | 資料 | 技術文獻 | 展會 | 耗材 | 配件 | 新品 | 促銷 | 書籍 | 招標 | 優質儀器
廣告

您的位置: 首頁 >技術文獻 >技術交流 >古朵新聞:為什么 PCR 跑不出滿意的結果?

古朵新聞:為什么 PCR 跑不出滿意的結果?

提供者:上海古朵生物科技有限公司   發布時間:2019/11/14  閱讀次數:35次   進入該公司展臺

PCR 是一個坑,坑里埋了好多研究僧……

PCR 是眾位「研究僧」日常實驗中最常用的技術,可謂是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映,這道菜不好吃,一不小心就「小河里翻船」。

那么,我們該如何把這道菜「吃好」、跳出這個「坑」呢?

諸位看官莫急,待我送君「三大法寶」。

一、確保 RNA 樣本合格

常見的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法,這兩個方法各有所長,但都不能保證提取的 RNA 樣本一定合格。

因而,提取完成后應測定 RNA 的濃度及吸光度。通常,在 260,280,230 nm 處分別測定其吸光度(A260、A280、A230)并計算其比值(A260 /A280,A260 /A230)。

那么,這幾個數值及其比值分別有何意義?

A260 為核酸的吸光度,A280 為蛋白質的吸光度,A230 為其他雜質(多糖等)的吸光度。純 DNA 的 A260 /A280 為 1.8,純 RNA 的 A260 /A280 為 2.0。

如果 OD 比值不在范圍內該如何解決呢?

再次洗滌樣本!

75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗滌;若采用 TRIzol 法提取 RNA,可直接洗滌兩次。洗滌后離心時可兩次分別將 EP 管置于不同的方向,便于徹底洗滌 RNA 樣本。通常洗滌兩次后可使測得的 OD 值較為理想。

二、 利用「RNAstructure」軟件

引物,是進行熒光定量實驗的必備條件。其特異性的問題可通過「BLAST」搞定,讓人比較頭痛的是引物可以形成「發夾結構」或「二聚體」(即在<75℃ 時出現溶解曲線的峰),影響擴增效率,最終導致實驗結果不可用。

那么,這個問題能否解決呢?

有!設計引物的時候用「RNAstructure」預測一下引物的二級結構即可。

那么,這個軟件要如何使用呢?

1. 打開「RNAstructure」,單擊左上角的「new sequence」按鈕:

2. 新建序列文件,會出現一個對話框,輸入待檢測的引物序列:

3. 單擊「Fold as DNA」,「save changes」,出現新的對話框后直接點擊「Start」:

4. 無需更改其他參數,再次點擊「Draw structure」,即可得到目標序列的二級結構:


  • 若考察引物能否形成發夾結構,則直接檢測 Forward 或 Reverse 引物即可。

  • 若考察引物能否形成二聚體,則把兩條引物一起輸入,視作一條序列進行檢測即可。

在得到二級結構圖后,只要沒有連續 4 個以上的配對即可;若一條引物長度為 20 bp,在 18~22 處有連續 5 個的堿基配對,則可「手動拆解配對」,即保證引物為兩條鏈時的配對不多于 4 個即可。

三、保證擴增效率符合要求

有童鞋反映,兩個同類基因測試同一批樣本,理論上趨勢應該一致,結果卻是兩種趨勢,應該相信哪個呢?

不知道各位看官有沒有遇到類似的問題?這類問題該如何解決呢?

先說說出現這類問題的原因吧:

1. 擴增條件非最佳;

2. 樣本中含有抑制擴增的物質,如乙醇。

一對引物有其特定的 Tm 值,但 Tm 值時未必是其最佳擴增溫度。溫度過高時,擴增效率過低,差異部分的目的基因不能被擴增,導致「假陰性」結果的出現。

那么,如何確定擴增效率是否滿足要求呢?

通常,拿到新引物后應從 Tm- 5℃ 尋找其適宜的擴增溫度,在某溫度起為特異性擴增。

然后,在特異性擴增的溫度下檢測擴增效率:將 cDNA 梯度稀釋(一般為 2×),測試稀釋后的樣本 Ct 值差異是否為 1 左右。

  • 若差值為 1,則擴增效率良好,可進行正式實驗。

  • 若在特異性擴增的溫度范圍內不能使 Ct 值差異為 1,則需考慮重新設計引物。

優質商品

X射線熒光光譜儀
X射線熒光光譜儀

旗下頻道

色譜儀 光譜儀 反應釜 試驗箱 試驗機 攪拌器 培養箱 離心機 水分測定 氣體檢測 量熱儀 石油儀器 純水器 比表面儀 溫度記錄 流量計 萬用表 顯微鏡 粒度儀 測厚儀 硬度計 酸度計 元素分析 生物試劑 電線電纜 天平衡器 傳感器 食品檢測 壓力儀表 電化學 測厚儀 閥門儀表 電力儀表 干燥設備 藥物檢測
99真人在线网址_99真人最新网址_99真人官方网址 1xbet在线网址_1xbet最新网址_1xbet官方网址 优乐在线网址_优乐最新网址_优乐官方网址 众鑫在线网址_众鑫最新网址_众鑫官方网址 爱赢最新网址_爱赢最新网址_爱赢最新网址 爱拼最新网址_爱拼最新网址_爱拼最新网址