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遠慕生物:Western Blot中的三大常見問題

提供者:上海遠慕生物科技有限公司   發布時間:2019/9/9  閱讀次數:190次   進入該公司展臺

Western Blot已經成為實驗室中檢測蛋白質的常規手段。不過想要得到一張條帶清晰、沒有雜帶、背景干凈的圖片,還是具有一定挑戰性的。我們在做蛋白電泳和Western Blot時,多數都用的Bio-Rad公司的儀器,所以Bio-Rad蛋白方面的技術專家的確可以稱之為專家,因為每天都有很多人向他們請教。他們就將最常見的問題整理成《Western Blotting Troubleshooter》。我們節選了一部分,希望能幫你節省一些查資料的時間。

Q:我的結果是膜上一片空白。為什么會這樣?

A:導致這種結果的因素很多。

膠和膜放反了 如果在轉印的過程中,膠和膜的位置顛倒了,那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中,而不會到達膜上。對于標準的轉印,凝膠應靠近三明治的負極,而膜對應正極。

轉膜效率低 轉膜效率受多種因素影響,包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的pH值。一般說來,蛋白越大,轉移得越慢。轉移大蛋白最好的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會穿出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2 um孔徑的NC膜或PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值,那么這個蛋白攜帶的電荷很少,在電場中也幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的,那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。


在轉印之后,你可以通過染膠或第二塊膜來判斷轉印效率。為了幫助你直接監控轉印效率,Bio-Rad也提供了多種預染Marker,它們在電泳以及轉膜之后可直接觀察到。

試劑放置太久或存放條件不正確 抗體會慢慢降解,如果反復凍融的話,它會快速降解。底物應儲存在-20°C。

抗體不純或滴度太低 一抗的濃度差異很大,應該根據經驗來決定一抗的稀釋度。過猶不及,太多的抗體也會阻礙抗原與抗體的結合。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養上清,以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。

酶失活了 疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要在HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中,而無副作用。另外,自來水或用聚苯乙烯樹脂去離子的水也可能會使酶失活,只能使用蒸餾的去離子水。

使用Tween-20洗滌 Tween-20(吐溫-20)可能會干擾某些抗體-抗體相互作用,或洗走NC膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時它的終濃度只有0.05%-0.1%,但仍可能會影響結合。因此除了封閉之后的第一次洗滌,其他洗滌過程中都不使用Tween-20,不過,這可能會使背景升高。

檢測系統缺乏足夠的靈敏度 確保蛋白的上樣量在檢測系統的靈敏度范圍內:
    辣根過氧化物酶          500 pg/band
    堿性磷酸酶                100 pg/band
    增強的堿性磷酸酶           5 pg/band
    膠體金                      100 pg/band
    增強的膠體金               10 pg/band
    Immun-Star 化學發光  10 pg/band

Q:我的western blot總是背景過高,如何解決?

A:背景過高可能是由很多因素引起的:封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉移緩沖液或設備有污染、抗體稀釋度不對或抗體不純。

封閉不完全 一抗或二抗只要結合到膜上,就會顯色。為了避免非特異性的結合,應用封閉液孵育膜,使所有的空白位點都被封閉蛋白占有。NC膜推薦的封閉液是3%的明膠。在室溫孵育1小時。明膠不能在4℃孵育,因為它會凝結。如果想要低溫封閉的話,可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。脫脂奶粉不能與Bio-Rad生物素化的蛋白標準一起使用。脫脂奶粉濃度過高也可能會產生背景。

顯色過度 顯色時間的長短取決于蛋白條帶的數目以及你想要的靈敏度。如果膜在顯色液中放置太久,背景就會偏高。應當在蛋白條帶清晰可見,而背景幾乎沒有或很少時,將膜及時取出。
洗滌不充分 在封閉以及抗體孵育之后,至少要洗兩次膜,每次5分鐘。去污劑的濃度不要太高,否則會把抗原從膜上洗下來。

轉移緩沖液或設備污染 使用清潔劑將轉印槽內外徹底清洗干凈。海綿墊也一定要認真清洗。臟的海綿墊通常是污染的最主要原因。另外,每次轉膜時的緩沖液都要是新鮮配制的。

抗體稀釋度不正確 一抗的稀釋度應根據抗體來源和經驗來決定。一般來說,以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養上清,以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。抗體稀釋度不夠,會產生非特異的結合,帶來高背景。

二抗不純 沒有交叉吸附過的二抗可能會與膜上的其他蛋白相互作用,產生雜帶。

Q:在轉膜的過程中,緩沖液總是很熱,我該怎么辦?

A:如果緩沖液過熱,它就會分解,產生更多的熱量。這可是一個大問題。為了避免分解,一定要確保你的冷卻設備沒問題,使用的是推薦的緩沖液,而且不在過高的功率下轉印。

足夠的冷卻條件 在大部分情況下,都應當使用循環冷卻水來進行冷卻。在冷庫中轉印,或將轉印槽放置在冰浴中都是不行的。因為大部分轉印槽都是塑料做的,不能有效地散熱。另外,由于膠附近的緩沖液通常是靜止的,在轉印過程中應攪動來維持循環。

緩沖液 轉印緩沖液的離子濃度必須是已知的,來防止過熱。如果離子濃度過高,電壓就應該降低(恒流轉印),如果是恒壓轉印的話,就會過熱。

功率條件 轉印過程中產生的熱是與功率成正比的。我們都知道,功率是電壓與電流的乘積。P="IE" 而電壓、電流和電阻又滿足這個等式:R="V/I。當緩沖液分解時,電阻下降。如果電壓是恒定的,則電流上升。因此,功率上升,產生更多的熱量。如果電流是恒定的,則電壓和功率下降,使蛋白轉移得更慢。

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