旋乐吧网址

首頁 | 產品 | 求購 | 資訊 | 專題 | 找廠商 | 打聽 | 人才 | 品牌 | 資料 | 技術文獻 | 展會 | 耗材 | 配件 | 新品 | 促銷 | 書籍 | 招標 | 優質儀器

您的位置: 首頁 >技術文獻 >技術交流 >ELISA實驗中常見出現問題及解決辦法

ELISA實驗中常見出現問題及解決辦法

提供者:上海elisa生物技術有限公司   發布時間:2019/7/30  閱讀次數:155次   進入該公司展臺

  ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。除了盒子本身質量外,操作中很多因素都影響試驗的正常結果。最常出現的問題是顯色淡,靈敏度偏低、重復性不佳、假陽性結果和假陰性結果,不管出現什么樣的結果,不但浪費客戶的金錢、樣本、精力,更重要的是對臨床做出了危險判斷。在這里我們分析ELISA試驗非正常檢測結果產生的常見原因,并探討其解決辦法,以提高檢測質量。
 
   一、顯色淡,靈敏度偏低
 
    1.試劑盒在運輸途中時間太長,溫度太高;所以盡量縮短運輸時間,夏季應放冰塊降溫。
 
    2.試劑盒未充分平衡;所以試劑盒從2~8℃冰箱取出后打開盒蓋,于室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)。
 
    3.培養箱溫度不足37℃,應注意培養箱溫度,放入反應板后盡量減少開啟次數以免影響溫度恒定,非隔水式培養箱尤其應注意。
 
    4.保溫時間不足;所以做實驗時一定注意時間的重要性,如果怕忘了時間,可以校正定時鐘準確定時。
 
    5.洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數增加;按說明書要求保留洗滌時間,準確記住洗滌次數。
 
    6.移液器吸液量不足,吸嘴內壁掛水太多或內壁不清潔;所以保證校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密,吸嘴內壁要清潔,最好一次性使用。
 
    7.蒸餾水水質有問題,要使用新鮮合格的蒸餾水。
 
    二、重復性較差,經常有客戶反饋說做了兩個復孔值相差太大。可能的問題有:
 
    1.樣品數量多少不一,加樣時間有長有短;所以重復某一樣品時,加樣時間盡可能接近。
 
    2.保溫時間不一致,洗滌條件不一致,操作人員不一致;重復測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性。
 
    3.加樣量不一致;樣品稀釋前應充分混勻,盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。
 
    三、假陽性結果和假陰性結果
 
    1.標本的采集與保存
 
    1.1當標本采集保存不當產生溶血時,紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中,血紅蛋白具有過氧化物酶的性質,其通過吸附或“PP效應”(蛋白質間相互吸附的現象)結合后,可催化A、B液顯色而造成假陽性
 
    1.2標本采集保存不當致細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,會產生假陽性反應;標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG聚合,易使間接法的試驗本底加深。因此,標本宜在新鮮時檢測。
 
    1.3反復凍融血清會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測,宜少量分裝凍存。
 
    2.加樣
 
    2.1  如果 樣品稀釋液少加或血清多加,都會引起本底增高。對于間接法來說,受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強,非特異性IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多,高于規定的稀釋倍數,極易造成高值陰性。反之,造成假陰性。
 
    2.2   如果加入的酶結合物過多或加在較高的孔壁上或孔口,也會引起本底升高或假陽性。
 
    2.3  如果血液未開始凝固或凝固不完全時就強行離心分離血清,此時的血清中仍留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結果。
 
    3.溫育
 
    3.1 由于ELISA試驗在一定溫度下的反應時間并不是反應的終點,溫育時間過短、溫度過低,易致顯色不全;溫育時間過長、溫度過高,易致非特異性結合緊附于反應孔周圍,難以清洗徹底,產生陰性高值或假陽性反應。因此,要嚴格按規定的溫度和溫育時間進行。
 
    3.2 由于水浴較難將溫度控制在穩定的范圍,因此我們每次試驗時應認真觀察水浴箱的溫度,盡量少開啟水浴箱門,嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時,微孔板不可重疊放置,以保證傳熱均勻,各板的溫度都能迅速達到平衡。
 
    3.3 由于試劑盒通常設定的反應溫度為37度,在這個溫度下溫育一定時間,蒸發的水分會很多,對于整個反應體系來講,各種反應物的濃度會不斷地增加,這樣必會導致反應最后的值升高。因此溫育時應貼上封板膠。
 
    4.洗板
 
    洗板在ELISA過程中雖不是一個反應步驟,但卻是決定試驗成敗的關鍵。ELISA就是靠洗板來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的,通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗板時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。在ELISA操作中,洗滌是最主要的關鍵技術,應嚴格按要求洗滌。洗板如不徹底,有酶結合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標本內的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標記抗體作用而產生干擾。
 
    4.1 各廠家的洗液是根據各自試劑的條件配制的,因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應結果,包括本底升高,所以不同廠家的洗液不應混用。
 
    4.2 洗液應按規定的倍數稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的,過多稀釋洗液,會影響洗液的效果,而使反應的本底升高。反之造成假陰性。
 
    4.3 稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水,電導率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子,這些離子會占用表面活性劑,使試驗本底增高。
 
    公司為廣大客戶提供高質量的免疫學和生命科學相關產品。質量可靠,被全國各大院校科研機構認可并指定為elisa試劑盒標準品對照品長期供應商。我們將以專業執著,精益求精的精神服務于廣大科研用戶。

優質商品

X射線熒光光譜儀
X射線熒光光譜儀

旗下頻道

色譜儀 光譜儀 反應釜 試驗箱 試驗機 攪拌器 培養箱 離心機 水分測定 氣體檢測 量熱儀 石油儀器 純水器 比表面儀 溫度記錄 流量計 萬用表 顯微鏡 粒度儀 測厚儀 硬度計 酸度計 元素分析 生物試劑 電線電纜 天平衡器 傳感器 食品檢測 壓力儀表 電化學 測厚儀 閥門儀表 電力儀表 干燥設備 藥物檢測
99真人在线网址_99真人最新网址_99真人官方网址 1xbet在线网址_1xbet最新网址_1xbet官方网址 优乐在线网址_优乐最新网址_优乐官方网址 众鑫在线网址_众鑫最新网址_众鑫官方网址 爱赢最新网址_爱赢最新网址_爱赢最新网址 爱拼最新网址_爱拼最新网址_爱拼最新网址