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實驗新手講解自己的ELISA操作流程

點擊次數:24291 發布時間:2016/9/6 9:45:38

實驗新手講解自己的ELISA操作流程,您沒見過吧,本章就由我司一個客戶朋友親身講講他自己的實驗經歷。讓我們一起閱讀!
給師弟科普ELISA基本步驟。與其寫個文檔,不如直接寫帖子,反正工作量一樣。我自己做ELISA也只是初學者,所以說得不對的地方,請大家多多指正。
ELISA有白底(上圖,不可拆)和黑空板子(可拆,8個一排,12排)。用吸光度(一般是450nm的OD值)來檢測,就只能用白底的板子。黑底的板子可以用Lumin讀數。
步,拿到板子,還有封蓋膜。
第二步:用100ul包被抗體,包被好板子之后,輕彈混勻。將封蓋膜的白色撕去,用透明有粘性的膜,貼在板子上,把膜壓緊(貼膜是為了防止液體揮發,所以一定要把每孔黏牢)。
室溫孵育過夜。
注意事項:
1.如果一次只做一部分孔,貼膜可以剪刀剪開,只用一部分。保證膜可以把加液后的孔蓋住就可以。
2.加樣時候,一定要保證每孔加樣量完全一樣。避免因為操作原因,每孔液體量有區別。ELISA比較敏感,操作誤差會導致*后讀數有不小的差別。
3.加的樣,保證樣品加在孔底,不要粘在管壁上,減少孔與孔之間的差異。
第二天早上,來洗掉包被液。
注意事項:
1. ELISA用的所有液體系統,記得一定要預先調PH值到7.2-7.4之間,按照說明書都無菌過濾過。1XPBS的PH值在7.68左右,仍然需要加鹽酸調酸一點。Trizma base配出來,PH在9.98,必須調PH!否則ELISA中抗原抗體根本不能正常結合。蛋白對于PH值極度敏感。
2. 無菌要求多高,現在不知道。建議無菌配好的液體放在4度冰箱保存。每次用之前,放在室溫下至少15分鐘。ELISA用的液體,室溫的溫度,效果比較好。
洗包被液的時候,直接把板子翻過來,棄掉液體。在厚厚的吸水紙上,用力拍打板子,力求把孔中的液體完全棄干凈。
用WASH BUFFER洗滌三次。因為孔的容量是400UL,但是300UL基本就可以把孔覆蓋滿。所以,建議洗板子的時候,每孔加350ul左右。
注意事項:
1.每次洗滌的時候,盡量拍干孔中液體。這樣洗滌得比較干凈。
2. 孔中沒有液體時候,動作一定要快!!!ELISA包被后的孔,絕對不能干掉!否則非常影響結果。

3.封閉。
用是1%BSA in 1XPBS. 無菌過濾,4度保存,用之前放在室溫復溫。
封閉液可以封閉全孔,所以每孔加300UL封閉液,室溫1小時。

4. 棄掉封閉液,拍干。
洗滌三遍。步驟如前。

5. 加標準品和樣品。
標準品儲存濃度很高,而且蛋白很忌反復凍融。建議次使用時,分裝。可以48孔一只,-80度冰箱保存,可以有效保存半年。4度保存,有效期是60天,而且濃度會衰減。
取16孔標準品的量。舉例,我的標準品儲存濃度是270ng/ml, 標準品分7個點,濃度是1000pg/ml,每孔100ul, 2倍遞減,所以是1000, 500, 250, 125, 62.5 , 31.2, 15.6 pg/ml, 7個孔我需要0.2ng標準品。
做ELISA必須有復孔。所以,兩排14個孔我需要0.4ng標準品, 1.5ul。
標準品稀釋步驟:
取7個EP管,第1管放400ul緩沖液,第2到7管放200ul緩沖液。將1.5ul標準品加入到管中,200ul槍輕輕吹打混勻。從第1管中取200ul加入第2管中,吹打均勻。依次稀釋。第7管有400ul液體,*后只用200ul。
標準品加樣步驟:
從第1管中取100ul加到A1孔,再100ul加到A2復孔中。
第2到7孔,參考上述步驟。
第8孔,H1和H2加沒有標準品的緩沖液,作為陰性對照。
樣本加樣:
血清或者細胞上清,解凍之后混勻,建議3000RPM離心10分鐘,沉淀液體中的固體雜質。
按照順序,每孔加100ul樣本,記得做復孔。加樣體積一定要一樣,但是動作要快。樣本還是一定要保證加到管底,不要粘附到管壁上。

標準品和樣品,每孔100ul,室溫孵育2小時。
6. 棄掉液體,拍干。洗滌3遍。
7. 加檢測抗體(detection antibody,尾端有生物素biotin),每孔100ul(儲存液也是放-80度,用之前解凍后加緩沖液混勻,稀釋到工作濃度,緩沖液的PH值都已經調到7.2-7.4之間)。
室溫孵育2小時。
備注:以上這些步驟沒有要求避光。所以,每次加樣之后,只要保證把貼膜都貼牢,防止液體蒸發和孔間干擾即可。
板子可以放在操作臺上。
不過因為操作習慣,即使不避光的步驟,也可以把板子放在室溫的抽屜里。

8.棄掉檢測抗體液,拍干。
洗滌三遍。
9. 加Streptavidin-HRP(親和素-辣根過氧化物酶),這個一直4度保存,使用的時候200倍稀釋(96孔,9.6ML液體,加48ul的Streptavidin-HRP,9552ul的緩沖液)。
100ul每孔,室溫,避光(這步開始要避光),孵育20分鐘。
10. 棄掉液體,拍干。洗滌三遍。
11. 加底物液(substrate solution),A液:B液=1:1,用之前臨時混起來。儲存的時候A,B兩液分別儲存在4度冰箱。
每孔100ul(等于每孔A液50ul,B液50ul),室溫,避光,20分鐘。
說明:
1. 加AB液之后,白色的孔就會顯色。淡綠色,顏色深淺跟目標蛋白濃度正相關。
2. 生物素與親和素結合,可以放大免疫反應的效應,便于顯色。
3.ELISA包被的板子采用平底(flat),大概60個96孔板,260美元左右。
白色的板子雖然不能拆卸,但是不用的孔,只要別污染,下次可以用,所以一塊板子等同于可以拆開來用。
12. 保留AB液在孔內,直接每孔加50ul的終止液(2N H2SO4)。終止液也是公司買的專門ELISA用的。
加完終止液,輕彈板子,混勻。可以看見淡綠色變為亮黃色。黃色的顏色深淺,與綠色一致,與目標蛋白的濃度成正相關。
加完終止液,立即到機器上讀數。選擇450nm,測OD值。
說明:不常做ELISA的實驗室,請務必在實驗之前,確認吸光度檢測儀器在正常使用狀態。如果儀器狀態不好,讀數不準,ELISA的結果也不可信。
附圖的板子顏色,是我昨天的結果,室溫放了一個晚上之后,今早來看,
顏色普遍都黃色,雖然還有顏色深淺的區別。
剛做出來的時候,顏色淡的近乎白色,幾乎沒有黃色。


X,Y軸都取對數之后,可以看見點與點之間成直線。
但是,R2只有0.967,一般比較好的標準曲線,應該是0.99左右。
D1與D2的重復性不好(標準品濃度,125pg/ml),可能是個人操作原因。
根據標準品得到的公式,就可以根據OD值來計算各個樣本檢測濃度。

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