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細胞凍存方法、步驟及注意事項

點擊次數:10437 發布時間:2015/2/12 10:14:48

細胞越來越受廣大科研者的喜愛,但細胞不像人們想象中那么強大,在培養復蘇等過程中稍有不慎就不可能導致它的死亡。而且它必須是是在無污染的條件下培養,復蘇才能保證實驗效果。在此恒遠公司技術為您詳細總結細胞的正確冷凍保存方法、保存詳細步驟,相關注意事項如下:
 
一、保存方法(主要有兩個):
(1)傳統方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3
℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

二、步驟:
(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養基,觀察細胞生長情形。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養基中,*后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
(3)依細胞繼代培養之操作,收集培養之細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
(4)離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標示完全之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

三、注意事項:
(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態,約為80–90%致密度。細胞凍存前應保證細胞的活力好,無污染
(2)冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質,例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
(3)3.一定要保證DMSO的濃度是10%,凍細胞要舍得用進口的DMSO
(4)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4
℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。
(5)慢凍,快解凍。細胞在 -15 度左右胞內形成結晶對細胞損傷,緩慢降溫有助于減少損傷,故放入 -20 度冰箱中凍存可實現緩慢降溫較為方便,保存時間過久會影響細胞活力。

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